在微生物抗菌技术研发领域，针对耐药性致病菌的噬菌体研发是当下热门方向。畜禽源大肠杆菌耐药性逐年加剧，常规抗菌方案失效，促使行业加大对裂解性噬菌体的研发投入。而宿主谱狭窄是天然噬菌体的共性技术痛点，这就要求研发人员建立标准化、可复现的噬菌体筛选流程，定向筛选宽谱活性噬菌体。本文结合完整实验案例，详解从样本采集、菌株分离、噬菌体筛选到性能验证的全流程技术要点，同时展示试验数据与技术结论，为同类微生物研发项目提供实操参考。本次试验目标为：从养殖污水中完成噬菌体筛选，获得可裂解猪、鸡、牛多源大肠杆菌的宽谱噬菌体，并完成体外杀菌效果量化评估。![]()
试验前期核心工作为样本采集与致病菌分离鉴定，这是噬菌体筛选的基础前提。试验样本采集自辽宁、北京、新疆三地规模化养殖场，包含患病畜禽病灶样本与养殖污水样本，所有样本低温冷藏转运至实验室，避免微生物失活。细菌分离采用选择性培养基分离法，分别使用麦康凯培养基、伊红 - 美蓝培养基划线接种，37 ℃恒温培养 24 h 后挑取典型菌落。大肠杆菌在两种培养基上会形成特征性菌落，结合革兰氏染色镜检（菌体为红色杆状）完成初步判定。初筛菌株进一步接入 LB 液体培养基振荡培养，制备对数生长期菌液。分子鉴定环节采用 16S rRNA PCR 技术：取菌落制备 DNA 模板，使用通用引物进行扩增，扩增产物电泳后条带约 1500 bp，与目标片段一致。扩增产物测序后上传至 NCBI 数据库比对，最终确认 18 株目标大肠杆菌，菌株分类：猪源 2 株、牛源 2 株、鸡源 14 株。标准化的菌株分离与鉴定流程，保证了宿主菌的纯度，从源头规避噬菌体筛选过程中的杂菌干扰。
菌株库搭建完成后，进入核心环节 ——噬菌体筛选、分离与纯化。试验选用养殖污水作为噬菌体分离基质，具体操作参数如下：污水样本 8000 r/min 离心，取 1 mL 上清液，混合 20 μL 对数期宿主菌液、1 mL LB 液体培养基，设置培养条件为 37 ℃、140 r/min，连续培养 12 h。培养结束后再次 8000 r/min 离心 10 min，取上清液经 0.22 μm 无菌滤膜过滤，去除活菌与杂质，得到粗制噬菌体液。噬菌体纯化采用行业通用的双层平板法：底层为凝固的 LB 固体培养基，上层为混合了宿主菌的 LB 半固体培养基，滴加 10 μL 粗制噬菌体液，37 ℃孵育 4 h 后观察噬菌斑。为保证噬菌体为单一毒株，连续纯化 3 次，最终获得噬菌斑形态统一的烈性噬菌体 vB_Eco_E10。在噬菌体筛选实操中，离心转速、滤膜孔径、培养温度等参数直接影响分离成功率，0.22 μm 滤膜可完全截留细菌，仅允许噬菌体通过，是该环节的关键质控点。
完成噬菌体纯化后，依次开展宿主谱测定与体外杀菌试验，量化评估噬菌体的核心性能。第一部分宿主谱测定：针对 18 株大肠杆菌逐一进行裂解试验，操作方式与纯化阶段一致，通过噬菌斑有无判定裂解活性。试验结果统计：vB_Eco_E10 对 9 株菌株具备裂解能力，整体裂解率 50%；其中猪源菌株裂解 1 株、牛源菌株裂解 1 株、鸡源菌株裂解 7 株，实现跨物种裂解，达到宽谱噬菌体的筛选目标。第二部分为 12 h 动态体外杀菌试验，试验载体选用 24 孔细胞培养板，体系配置：3 mL LB 液体培养基 + 100 μL 菌液（浓度 1×10⁵ CFU/mL）+100 μL 噬菌体液（浓度 1×10⁸ PFU/mL）。试验分组设置：噬菌体 + 菌株组、纯菌株对照组、空白 PBS 对照组，每组设置 3 个生物学重复。每间隔 1 小时设置一组试验孔，培养 12 h 后统一使用酶标仪检测 OD600 数值，以此表征细菌生物量。
试验最终量化数据如下：所有受试菌株在培养 4~5 h 进入对数生长期，7 h 后生长放缓。对比对照组与试验组 OD600 数值，培养 12 h 后，噬菌体对猪源菌株 LNE10 的抑菌率为 36.8%；对鸡源菌株 LNB27、牛源菌株 LNL14 的抑菌率均为 15.8%。数据反映出该噬菌体对不同来源大肠杆菌的裂解能力存在差异，猪源菌株抑制效果最优，鸡源、牛源菌株效果次之，该现象与不同菌株表面噬菌体受体的表达量相关。从技术层面分析，本次通过噬菌体筛选得到的 vB_Eco_E10，其跨物种裂解特性，证明该噬菌体识别的受体在畜禽源大肠杆菌中具有保守性，这也是宽谱噬菌体的典型特征。
总结整套试验流程与技术要点：样本溯源选择本土养殖污水，能提升噬菌体筛选的适配度；双层平板法结合多次纯化，可保障噬菌体单一性；多源菌株库能全面验证噬菌体宿主谱。本次试验得到的 vB_Eco_E10 各项性能指标稳定，可纳入噬菌体资源库，作为复合噬菌体制剂的核心原料。对于微生物研发团队而言，本套标准化流程可直接应用于其他致病菌的噬菌体筛选工作。后续技术优化方向可聚焦于：扩大菌株验证范围、优化培养条件提升噬菌体活性、开展多噬菌体复配试验，进一步提升杀菌谱与抑菌效率，推动该技术从实验室走向产业化应用。
参考文献：宋蕊，刘衍芬，贺永明，等.1 株宽谱型大肠杆菌噬菌体筛选及杀菌效果评估 [J]. 辽宁农业职业技术学院学报，2026,28 (3):1-4.
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